Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5

Fig. 1. Marcheri utilizaţi în analiza variabilităţii genetice la arbori.

1 - marcheri moleculari (ADN) cantonaţi în nucleul celulelor sau în zonele genofore ale cloroplastelor si mitocondriilor; 2 - marcheri izoenzimatici rezultaţi în urma transcrierii şi translaţiei genelor adecvate în citoplasma celulelor; 3 - marcherii terpenici rezultaţi în urma unor multiple reacţii metabolice în diferite compartimente ale citoplasmei celulelor secretoare şi deversate în final în canalele sau pungile rezinifere; 4 - marcheri fenotipici (morfologici, anatomici, fiziologici); n = nucleu; mt = mitocondrii, p = plastide; r = ribozomi liberi din citoplasmă; reg = reticul endoplasmatic granular; ren = reticul endoplasmatic neted; ag = aparat golgi; v = vacuole; m = membrana plasmatică; p = perete celular.

Fig. 2. Principiul metodei RFLP de realizare a amprentelor genetice la arbori

1 - izolarea ADN genomic de la organismele de interes; 2 - digestia ADN cu enzime de restricţie; 3 - separarea fragmentelor de restricţie prin electroforeză în gel de agaroză; 4 - gelurile obţinute sunt denaturate, neutralizate şi fixate pe o membrană, nivel la care se realizează o hibridizare a fragmentelor de ADN cu anumite sonde marcate radioactiv iar fragmentele complementare (de care se ataşeaza sondele) sunt vizualizate prin autoradiografie (sau prin tehnici neradioactive).

Fig. 3. Principiul metodei RAPD

ADN este extras dintr-un fragment vegetal (frunze, muguri, seminţe, etc.) de la plantele de analizat (P1 şi P2). Aceste molecule ADN sunt amplificate sub acţiunea enzimei ADN-polimeraza. Acţiunea acesteia începe de la locul unde o amorsă (am) se hibridizează cu un anumit sector denaturat al dublei catene de ADN. Pe catena complementară de ADN, amorsa recunoaşte un sector similar situat la câteva sute de nucleotide de precedentul şi se hibridizează cu acesta în acelaşi mod. ADN-polimeraza copie secvenţa de ADN cuprinsă între cele două amorse de pe catenele opuse, în milioane de exemplare (amplificare) în cursul a 35-40 de cicluri repetate ale tehnicii PCR.

De exemplu, segmentul AB de ADN de la planta P2 care este mai mic decât cel de la planta P1 ca urmare a unei mutaţii (deletii sau rearanjament), va migra mult mai repede în timpul electroforezei în gel de agaroză decât segmentul AB de la planta P1 care este mai mare şi mai greu. Aceste segmente amplificate vor fi vizualizate în lumină ultravioletă, sub forma de benzi fluorescente, graţie prezenţei în gel a unui reactiv fluorescent care posedă o mare afinitate pentru ADN.

Fig. 4. Analiza prin metoda RAPD a unei provenienţe de brad

ADN de la 20 de exemplare a fost amplificat plecând de la o amorsă. Diferitele benzi de ADN amplificate sunt separate în funcţie de talia lor prin electroforeză în gel de agaroză şi vizualizate prin fluorescenţă în prezenţă de bromură de etidiu în lumină ultravioletă. Linia M reprezintă un marcher de referinţă pentru greutatea moleculară.

Diferenţele dintre indivizi în cadrul unei provenienţe sunt astfel puse în evidenţă. Fiecare bandă este consemnată pentru prezenţa sau absenţa sa pentru fiecare exemplar în parte. Ansamblul de date obţinut plecând de la mai multe amorse, permite estimarea diversităţii genetice în cadrul unei provenienţe sau între provenienţe sau între provenienţe.

Fig. 5. Aplicaţii ale metodei RAPD-SCAR în cercetarea fragmentelor ADN care diferenţiază două populaţii de arbori.  

a) Recuperarea amorselor aleatoare

Se compară profilurile benzilor obţinute în urma amplificării pentru n arbori aparţinând la două populaţii de arbori. Se selecţionează fragmentele care manifestă difereneţe semnificative de frecvenţă între cele două populaţii.

            b) Clonarea şi secvenţierea parţială a fragmentelor selecţionate  (de exemplu, a fragmentului c). Identificarea secvenţei de baze (secvenţierea) se realizează numai pentru extremităţile fragmentului şi pe această bază se realizează două amorse de 20 kbaze complementare cu extremităţile fragmentului c.

            c) Amplificarea dirijată a ADN de la n arbori pentru cele două populaţii studiate, cu ajutorul amorselor noi, urmată de digestie cu enzime de restricţie a fragmentului c. Benzile rezultate în urma electroforezei permit calcularea frecvenţei alelice. Utilizarea noilor amorse permite amplificarea numai a fragementului c la toate exemplarele analizate. Dacă există un polimorfism în interiorul fragmentului, digestia cu enzime îl va detecta (fragmentele c’, c”).