Marcheri genetici moleculari ai speciilor forestiere

- Ancuţa Mihaela Lucău-Dănilă -

Introducere

Resursele şi variabilitatea genetică a arborilor forestieri sunt încă destul de puţin cunoscute. Pe plan fundamental, dezvoltarea tehnicilor de marcaj molecular deschide noi căi de investigare a diversităţii genetice a arborilor. Aceste metode interesează în egală măsură silvicultura şi ameliorarea speciilor de interes practic.

          Cercetarea în domeniul geneticii forestiere vizează două categorii de specii. Prima categorie cuprinde speciile cu ciclu de viaţă scurt (între 40 şi 100 de ani) care deţin un loc important în economie: molid, brad, pini, plopi. Aceste specii fac obiectul unor programe de selecţie pe termen lung, care includ mai multe generaţii si se bazează pe genetica cantitativă şi pe teoria selecţiei. Cea de-a doua categorie cuprinde speciile cu longevitate mare, pentru care este mai dificil de definit obiectivele selecţiei, precum şi speciile al căror interes economic este mai puţin important. In acest grup se încadrează stejarii, fagul, speciile de altitudine. Nici un program de selecţie nu a fost angajat pentru aceste specii; au fost realizate împăduriri şi reîmpăduriri cu seminţe obţinute din pădurile actuale, nu din varietăţi ameliorate. In acest context îşi găsesc o foarte utilă aplicabilitate marcherii moleculari care permit studiul diversităţii genetice şi posibilităţile de selecţie în cadrul unor programe de ameliorare.

Organizarea diversităţii (variabilităţii genetice)

In concepţia modernă se recunosc două tipuri de variaţii individuale şi anume: variaţii determinate genetic şi variaţii induse de mediu.

Variaţiile determinate genetic sunt cele generate de acţiunea materialului ereditar (ADN) caracteristic fiecărui individ; acestea pot fi variaţii discontinue şi variaţii continue. Variaţiile discontinue se evidenţiază prin forme sau clase distincte, în cadrul aceleiaşi specii, fără treceri gradate între ele, aşa cum sunt, de exemplu, variaţiile rasiale, ecotipice sau cele polimorfice. Variaţiile continue sau clinale sunt reprezentate de o diversitate care se realizează gradat, fără clase distincte de fenotipuri, în funcţie de anumiţi factori de mediu care variază treptat.

Variaţiile determinate de mediu (variaţii neereditare) sunt variaţii discontinue numite şi "modificaţii", care nu au o bază genetică, fiind produse exclusiv sub acţiunea mediului. Nefiind fixate genetic, aceste variaţii se transmit la arbori numai pe calea înmulţirii vegetative.

Arborii manifestă nivele de diversitate genetică ridicate comparativ cu alte organisme. Menţinerea acestei diversităţi este o garanţie a perenităţii pădurilor, în special în contextul unor posibile schimbări climatice sau în condiţiile fenomenului de poluare şi degradare a mediului care se accentuează în prezent tot mai mult. Cercetările care au fost întreprinse pentru precizarea organizării diversităţii genetice la diferite niveluri ierarhice (arie de distribuţie, pădure, populaţie) au pus în evidenţă factorii biologici dar şi factorii antropici ai acestei diversităţi.

          Studiul variabilităţii genetice interpopulaţionale prezintă o dublă importanţă, fundamentală şi aplicată. O suprafaţă însemnată de pădure este regenerată plecând de la material de împădurire provenit din păduri naturale, respectiv din rezervaţii de seminţe alese în funcţie de proprietăţile lor fenotipice particulare (creştere, omogenitate, formă). De câteva zeci de ani au fost instalate şi plantaţii experimentale. Ele servesc la aprecierea variabilităţii caracterelor silviculturale ale populaţiilor din care provin şi în plan practic, la identificarea celor mai bune surse de seminţe pentru reîmpăduriri. Aceste plantaţii experimentale sunt de asemenea excelente mijloace pentru studiile de genetică a populaţiilor: ele cuprind un eşantion de populaţii de pe ansamblul ariei de distribuţie a unei specii. Compararea lor în plan molecular şi fenotipic permite înţelegerea evoluţiei populaţiilor de arbori forestieri.

Metode de interceptare a variabilităţii genetice la arbori

Studiul variabilităţii genetice în populaţiile de arbori debutează în anii 1930-1940, când s-au înfiinţat primele culturi comparative de provenienţe în care erau testate o serie de performanţe morfo-anatomice şi fiziologice ale arborilor. Numai recent, de circa 20 de ani, au început să se studieze în acest scop, marcheri genetici de diferite tipuri, odată cu dezvoltarea tehnicilor de laborator corespunzătoare.

    In prezent, studiul variabilităţii genetice în populaţiile de arbori se bazează pe următoarele metode (figura1):

1. Studiul indicatorilor morfologici, anatomici şi fiziologici înregistraţi în populaţii naturale sau în culturi comparative de provenienţe. Aceşti indicatori sunt supuşi influenţelor mediogene într-un grad foarte ridicat, ştiut fiind faptul că realizarea fenotipului presupune interacţiunea dintre genotip şi mediu (relaţia F = G + M). Din această cauză, estimarea variabilităţii genetice pe baza lor este dificil de realizat; adesea, caractere morfologice identice pot fi generate de gene diferite care se exprimă similar într-un anumit mediu; alteori, gene identice   pot  genera fenotipuri  diferite   sub   acţiunea  unui  mediu specific.

2. Studiul izoenzimelor, considerate marcheri biochimici foarte importanţi datorită faptului că ei reprezintă compuşi primari ai activităţii genelor şi au un control alelic simplu, bialelic sau codominant. Influenţele mediului nu se fac simţite la nivelul izoenzimelor, ceea ce face din aceşti marcheri instrumente precise şi rapide, foarte mult utilizate pentru estimarea variabilităţii genetice a arborilor.

3. Studiul terpenelor, marcheri biochimici care reprezintă produşi secundari ai activităţii genelor (pentru sinteza lor intervin numeroase enzime), ceea ce face ca aceşti marcheri să aibă un control genetic mai greu de estimat.

4. Studiul marcherilor moleculari ADN prin diferite metode ale biologiei moleculare. Aceşti marcheri relevă fidel variabilitatea genetică, nefiind supuşi influenţelor mediului. Analiza directă a genelor, cartarea genomului, detectarea şi secvenţierea diferitelor fragmente de ADN nuclear, cloroplastic sau mitocondrial, sunt metode de o precizie şi o rapiditate de diagnostic fără precedent, reprezentând instru-mentele cele mai valoroase pentru studiul diversităţii genetice, dar şi pentru cercetarea evoluţiei istorice (filogeniei), a taxonomiei, a fluxului genic în populaţii. Recent, aceşti marcheri au început să fie utilizaţi pentru analiza efectelor selecţiei în populaţiile de arbori, rezultatele fiind remarcabile.

Marcherii moleculari (ADN)

Baza moleculară a metodelor de marcare moleculară o reprezintă însăşi molecula de ADN, suportul fizic al eredităţii. ADN este unic pentru fiecare individ şi constituie materialul principal de construcţie a cromozomilor din nucleul fiecărei celule.

Dezvoltarea tehnicilor de identificare a polimorfismului ADN cu ajutorul aşa-numitelor "amprente genetice", a permis identificarea unui număr considerabil de loci genici şi studierea mult mai amplă şi precisă a variabilităţii genetice la arbori. Vizualizarea amprentelor genetice se realizează prin două strategii de bază şi anume: prin metoda clasică de hibridizare a ADN sau prin amplificare.

Metoda clasică de hibridizare a ADN presupune parcurgerea următoarelor etape (figura 2):

- tăierea ADN genomic cu ajutorul unor enzime de restricţie*;

- separarea electroforetică a fragmentelor ADN rezultate, în funcţie de mărimea lor;

- detectarea la nivelul benzilor electroforetice a locilor genici polimorfici (cei care prezintă variaţii); orice mutaţie care produce o modificare în mărimea segmentului ADN, de exemplu adiţii, deleţii, translocaţii de nucleotide, va conduce la o modificare mai mare sau mai mică a distanţei de migrare electroforetică a fragmentelor respective;

- fragmentele ADN găsite variabile (polimorfice) sunt ulterior transferate pe membrane de suport şi hibridizate fie cu sonde** ADN de secvenţă cunoscută şi marcate radioactiv sau neradioactiv pentru a putea fi uşor identificate, fie cu sonde reprezentate de aşa-numiţii sateliţi, mini-, micro- sau midisateliţi***. In acest fel pot fi urmărite anumite fragmente de ADN cu secvenţă cunoscută. Această tehnică este mereu perfecţionată şi la ora actuală este cunoscută sub denumirea de RFLP (restriction fragment length polymorphisms) sau polimorfismul fragmentelor lungi de restricţie.

Metoda de analiză a marcherilor ADN prin amplificare se bazează pe procedeul PCR (polimerase chain reaction) sau reacţia de polimerizare în lanţ. Acest procedeu presupune amplificarea "in vitro" a anumitor secvenţe de ADN cu ajutorul unor oligonucleotide (primeri sau amorse) specifice sau arbitrare şi cu ajutorul unei ADN-polimeraze termostabile. Separarea electroforetică a segmentelor de ADN amplificate şi detectarea benzilor polimorfice reprezintă strategia de bază a acestei metode care poartă denumirea de RAPD (random amplified polymorphic DNA) sau ADN polimorfic amplificat randomizat (figurile 3 şi 4).

Ambele metode au cunoscut numeroase modificări şi adaptări pentru identificarea cu mare acurateţe a amprentelor genetice la diferite specii de plante şi animale; recent, aceşti marcheri au început să fie utilizaţi cu rezultate spectaculoase în realizarea diagnosticului molecular la nivelul genomului uman.

Marcherii moleculari (ADN) se caracterizează printr-o serie de proprietăţi care îi recomandă ca instrumente deosebit de utile în studiul variabilităţii genetice a speciilor, în cartarea genomului, în studiile de filogenie şi taxonomie; printre aceste proprietăţi se numără: înaltul polimorfism, moştenirea codominantă (permiţând discriminarea stărilor de homo- şi heterozigoţie la organismele diploide), frecvenţa mare în genom, distribuţia uniformă în tot genomul, comportamentul exclusiv neutru (nu manifestă fenomene de pleiotropie), accesul facil (procedură de obţinere relativ simplă şi automatizată), certitudinea şi reproductibilitatea foarte mare a rezultatelor. 

Pentru a surprinde efectele selecţiei, respectiv determinismul caracterelor adaptative, au fost abordate două metode de studiu al marcherilor ADN şi anume: cercetarea marcherilor în încrucişări şi cercetarea marcherilor în populaţiile naturale.

Cercetarea marcherilor moleculari în încrucişări

Această metodă numită şi QTL (Quantitativ Trait Loci) presupune construirea unei hărţi genetice bazate pe consegregarea marcherilor în încrucişări controlate (în F2 prin back-cross sau retroîncrucişare); se cercetează regiunile ADN implicate în exprimarea caracterelor adaptative care pot da diferenţe între populaţii. Această metodă presupune analiza exemplarelor din generaţia a doua F2 rezultate în urma unor retroîncrucişări (încrucişări cu unul din genitorii iniţiali sau back-cross), pornind de la două populaţii care se cercetează. Metoda riscă să nu identifice decât un număr limitat de marcheri implicaţi în discriminare: numai marcherii polimorfici sunt identificaţi (marcherii care diferă între cei doi părinţi folosiţi la hibridare). Se porneşte de la ipoteza că alelele corespunzătoare acestor marcheri polimorfici, sunt fixate total în cele două populaţii. Ţinând cont de importanţa fluxului genic între populaţii şi istoria lor recentă, este foarte probabil ca alelele să nu fie fixate dar să aibă frecvenţe diferite între cele două populaţii.

Această metodă este aplicată în Franţa pentru pinul maritim, în încrucişări ale exemplarelor din F2 rezultate din hibridarea între o populaţie corsicană şi alta din land; caracteristicile lor forestiere sunt distincte: rectitudinea trunchiului este caracteristică populaţiei corsicane şi viteza de creştere este caracteristică populaţiei din land.

Cercetarea marcherilor moleculari în populaţiile naturale

Marcherii cu diferenţe în ce priveşte frecvenţele alelice între populaţii pot fi cercetaţi direct în populaţiile naturale, fără a cunoaşte rolul lor eventual în determinismul caracterelor fenotipice. Cum numărul marcherilor este limitat, apare necesară utilizarea unei metode care să parcurgă rapid genomul.

La ora actuală se utilizează din ce în ce mai mult în acest scop, marcherii moleculari detectaţi prin metoda RAPD. Această tehnică suferă totuşi o serie de imperfecţiuni  legate fie de protocolul de lucru, fie de calitatea informaţiei obţinute. Astfel, teoretic este posibil ca benzile asociate fragmentelor de talie egală în două populaţii diferite, să nu fie obligatoriu omoloage. Mai mult, fragmentele sunt adesea dominante, ceea ce nu permite estimarea frecvenţei alelice în populaţii. Din aceste motive, metoda RAPD trebuie considerată ca o fază preliminară la care trebuie adăugată o fază de validare a acestor fragmente.

Metoda de validare cea mai adecvată constă, după verificarea reproductibilităţii benzilor, în secvenţierea fragmentelor informaţionale la cele două extremităţi ale lor şi generarea de noi amorse mai lungi, plecând de la aceste secvenţe, care vor permite în continuare identificarea fragmentelor ADN prin amplificare dirijată. Această tehnică a fost simultan dezvoltată în mai multe laboratoare iar marcherii astfel identificaţi se numesc SCAR (sequence characterized amplified region) (figura 5).

Spre deosebire de cercetarea clasică a polimorfismului arborilor prin realizarea de încrucişări şi urmărirea descendenţei, metoda RAPD-SCAR aplicată populaţiilor panmictice are avantajul de a identifica toate fragmentele implicate în diferenţiere, nu numai cele legate direct de diferenţierea fenotipică între două populaţii, dar şi cele care pot elucida istoria evolutivă (filogenia) acestora.

Metoda RAPD-SCAR a fost aplicată la gorun (Quercus petraea), specie care s-a dovedit a fi foarte apropiată de stejar (Q. robur) şi de stejarul pedunculat (Q. pedunculiflora). Diferenţele astfel înregistrate s-au dovedit mult superioare celor furnizate de marcherii izoenzimatici utilizaţi la aceste specii. Prin utilizarea amplificării aleatorii (RAPD) s-a reuşit selecţionarea unui număr de 14 fragmente din 419 identificate; 8 din fragmentele ADN discriminatorii de la aceste specii de Quercus au fost secvenţiate şi procesul de cartare continuă la ora actuală şi pentru alte fragmente ADN precum şi pentru alte specii (Kremer, 1994).

          Organizarea diversităţii genetice citoplasmatice la arbori

Genomurile citoplasmatice se transmit în general uniparental. La angiosperme (speciile foioase), cloroplastele şi mitocondriile se transmit prin sămânţă, pe linie maternă. La gimnosperme (speciile răşinoase), cloroplastele au o ereditate paternă iar mitocondriile o ereditate maternă. Migrarea genelor citoplasmatice este deci a priori mai redusă decât cea a genelor nucleare.

O a doua consecinţă a eredităţii uniparentale vizează talia populaţiilor pentru genele citoplasmatice; ea este cel puţin cu jumătate mai redusă decât cea a genelor nucleare. Populaţiile de talie mică, asociate cu o slabă migrare, ar trebui să antreneze o foarte puternică diferenţiere a genelor citoplasmatice în raport cu genele nucleare, raţionament care a fost confirmat experimental (Petit, 1993).

La stejari, de exemplu, s-a constatat că o mare parte a arborilor unei păduri au un acelaşi citotip. O pădure vecină va prezenta un citotip diferit. Ideea utilizării polimorfismului pentru identificarea populaţiilor clasate (surse, rezervaţii de seminţe) s-a impus de la sine. Din păcate, numărul de citotipuri disponibile rămâne deocamdată puţin ridicat din cauza unei rate a mutaţiei foarte scăzute în genomul cloroplastic. Numai patru citotipuri diferite au fost identificate prin metoda RFLP clasică la stejari, deşi cercetarea mutaţiilor în acest genom a făcut obiectul unei intense cercetări.

Genomul cloroplastic a fost în întregime secvenţiat la numeroase specii vegetale, printre acestea fiind şi numeroase specii de arbori. Metoda folosită pentru aceasta, combină amplificarea genică şi utilizarea enzimelor de restricţie. Compararea secvenţelor astfel identificate cu baza de date informatizată care a fost creată (Kremer, 1994), permite reperarea segmentelor de ADN cloroplastic care sunt conservate la nivelul speciei respective. Inspirându-se de la aceste secvenţe, se pot crea diferite amorse şi pe baza lor se poate amplifica segmentul dorit din genomul cloroplastic; în continuare, secvenţele amplificate sunt digerate cu enzime de restricţie pentru a identifica mutaţiile. Ideal ar fi să se poată dispune de amorse "în şirag" pentru fiecare 2-3 kilobaze pe molecula de ADN cloroplastic, ceea ce ar permite o cercetare sistematică a polimorfismului. Această metodă laborioasă este mult mai eficace decât metoda RFLP, pentru studiul diversităţii genetice la nivelul cloroplastelor în mai multe populaţii de arbori. O dată combinaţiile genetice "amorsă - enzimă de restricţie" identificate, metoda se simplifică foarte mult. Astfel a fost posibilă identificarea a peste zece mutaţii în genomul cloroplastic la Quercus petraea (Demesure, 1992).

           Organizarea şi evoluţia diversităţii genetice într-o pădure

Dacă plantaţiile sunt adesea utilizate pentru "reînnoirea" unei păduri, regenerarea naturală este şi ea încă destul de larg răspândită. Ea constă în selecţionarea unui anumit număr de arbori seminceri pe o parcelă, tăierea celorlalţi şi lăsarea semincerilor să se reproducă liber între ei. Această operaţiune destul de delicată este determinantă pentru viitorul unei populaţii pentru că ea reprezintă o coordonare a evoluţiei diversităţii genetice a populaţiei respective. Se impune pentru aceasta, în primul rând o evaluare a nivelului şi organizării spaţiale a diversităţii genetice existente în pădure şi în al doilea rând, se impune o estimare a efectului factorilor biologici (regim de reproducere, flux genic) şi antropici (ca urmare a măsurilor silviculturale) asupra evoluţiei diversităţii.

Repetarea regenerărilor naturale în cursul generaţiilor succesive, duce inevitabil la o repartiţie a arborilor sub formă de buchete de exemplare înrudite. Migrarea seminţelor este adesea limitată ca distanţă, iar exemplarele învecinate au o şansă mare de a avea ascendenţi comuni. Cum cei mai apropiaţi vecini sunt în egală măsură polenizatori privilegiaţi, regenerarea naturală poate conduce la un ridicat nivel de consangvinizare. Pentru numeroase specii există argumente experimentale privind depresiunea de consangvinizare, marcherii genetici reprezentând şi în acest caz un preţios instrument de estimare a ratei de consangvinizare într-o populaţie. Foarte mult au fost utilizaţi marcherii izoenzimatici (la stejari, fag, conifere) şi au argumentat că arborii învecinaţi prezintă o similitudine genetică mult mai ridicată decât cei situaţi la distanţe mari.

In ce priveşte dispersia polenului sau a seminţelor, studiul se poate face pe două căi; prima consideră modelul dispersiei fizice sau diferite modele biofizice, cea de-a doua descrie fluxul genic cu ajutorul marcherilor genetici. Numărul de părinţi potenţiali fiind relativ ridicat, metoda de marcare nu este rezolutivă decât dacă se dispune de marcheri foarte variabili de tipul amprentelor genetice. Marcherii izoenzimatici dau rezultate puţin precise care nu permit estimarea separată a genelor care migrează prin seminţe sau prin polen. Identificarea marcherilor hipervariabili de tip mini- sau microsateliţi, ar trebui să amelioreze considerabil metodele de cercetare a paternităţii.

Pe de altă parte, accesul la marcherii care se transmit exclusiv la un singur părinte, ar trebui să permită estimarea părţii corespunzătoare fiecărui vector al fluxului genic. A fost deja evocată originalitatea eredităţii mitocondriilor şi cloroplastelor în special la conifere, unde primele se transmit pe linie maternă iar ultimele pe linie paternă. Această particularitate constituie un model ideal pentru studiul fluxului genetic. La ora actuală cercetările se limitează la verificarea eredităţii uniparentale a genomurilor cloroplastice şi raritatea heteroplasmiei (variabilităţii între genomurile citoplasmatice ale aceluiaşi exemplar). Au fost deja reperate zone hipervariabile în genomul cloroplastelor la conifere şi se speră că aceasta va permite într-un viitor foarte apropiat, identificarea genitorilor.

Un instrument pentru selecţie   

Vârsta târzie la care se poate evalua un arbore în plan genetic, constituie unul din inconvenientele majore ale schemelor de selecţie. Identificarea de marcheri legaţi de caracterele de interes agronomic, ar trebui să amelioreze cu mult schemele de selecţie ale arborilor forestieri prin reducerea ciclurilor de selecţie.

Teoretic, tehnicile de marcare reprezintă un instrument deosebit de util. Din păcate, perspectivele utilizării lor în această direcţie sunt reduse deoarece criteriile de selecţie sunt adesea foarte complexe, vizând simultan mai multe caractere (talia arborilor, adaptarea la diverse condiţii de mediu, forma, etc.) care depind de numeroşi loci genici. In plus, caracterele fenotipice vizate de selecţie manifestă o mare instabilitate genetică din cauza interacţiunii dintre genotipuri şi mediu pentru realizarea fenotipurilor. De aceea, pentru caracterele compuse, marcherii genetici sunt utilizaţi fără a cunoaşte pe deplin determinismul lor genetic; se studiază un număr de loci şi se estimează variabilitatea acestora în funcţie de mediu şi vârstă.

Pentru caracterele mai simple (rezistenţa la maladii, calitatea lemnului), cercetarea marcherilor legaţi de aceste caractere este deja considerată ca un criteriu suplimentar în multe scheme de selecţie (Lascoux, 1993).

Arhitectura genetică a caracterelor şi valoarea QTL

Metode recente ale geneticii moleculare au pus în evidenţă în genomul plantelor, zone determinante pentru caracterele de tip cantitativ (creştere, productivitate, conţinut în anumiţi componenţi, precocitate, durata înfloririi, etc.). Prin realizarea de hărţi genetice din ce în ce mai fine ale genomului plantelor, au fost puse în evidenţă zone numite QTL sau QTS (Quantitative Trait Loci or Segments) identificate prin tehnicile de marcare moleculară; se pare că aceste zone ar putea releva variabilitatea caracterelor celor mai importante pentru selecţie.

Construirea de hărţi genetice în cazul coniferelor este facilitată de prezenţa ţesutului haploid în cantitate suficientă pentru extracţia de ADN, în endospermul seminţelor (ţesut identic din punct de vedere genetic cu gametul femel). Accesul la ţesutul haploid permite construirea hărţii genetice atât cu ajutorul marcherilor izoenzimatici, cât mai ales cu ajutorul marcherilor moleculari, prin tehnica RAPD sau RFLP. La pinul maritim au fost realizate deja hărţi genetice plecând de la proteinele totale (cu densitatea genelor de 9 cM [entimorgan]) (Gerber, 1993) şi plecând de la marcherii moleculari identificaţi prin RAPD (cu densitatea genelor de 5 cM) (Plomion, 1994 cit. de Kremer, 1994).

Pe termen lung, aceste realizări vor lua în calcul şi variabilitatea spaţială a expresiei genelor (interacţiunea genotip-mediu). Descompunerea acestei variaţii de expresie se numeşte arhitectură genetică de caractere. Au fost deja obţinute o serie de rezultate care pun în evidenţă această variaţie de expresie graţie electroforezei bidimensionale a proteinelor totale. Compararea profilurilor benzilor electroforetice de la trei ţesuturi diferite (polen, muguri, ace) la pinul maritim, a arătat că majoritatea proteinelor sunt comune celor trei ţesuturi, iar proteinele "ţesut - specifice" prezintă un grad foarte ridicat de polimorfism (Bahrman, 1944). Acelaşi demers se foloseşte şi pentru compararea proteinelor într-un acelaşi ţesut (de exemplu, mugure apical), la două vârste diferite.

Dezvoltarea tehnicilor de marcare moleculară permit, pe lângă dezvoltarea cercetării în plan fundamental, posibilitatea de a formula noi perspective de gestiune a resurselor genetice forestiere şi de creare de varietăţi. Direcţiile prioritare la ora actuală sunt:

·        pentru conifere - studierea polimorfismului ADN în fază diploidă şi haploidă ceea ce va permite reconstituirea genotipului fiecărui gamet; de asemenea, este vizată utilizarea amprentelor genetice în genomurile citoplasmatice, cunoscută fiind transmiterea pe linie maternă a mitocondriilor şi pe linie paternă a cloroplastelor, ceea ce va facilita studiul detaliat al fluxului genic prin seminţe şi polen.

·        pentru foioase - studierea ciclurilor de selecţie şi urmărirea biodiversităţii în cursul operaţiilor de regenerare (Kremer, 1994). 

Noile tehnologii moleculare nu-şi propun să înlocuiască selecţia clasică a arborilor care are poziţia sa bine precizată în tehnicile de ameliorare forestieră şi care s-a dovedit foarte utilă pentru obţinerea unui câştig genetic important şi implicit a unei productivităţi sporite a ecosistemelor forestiere, în schimb îi vor mări foarte mult eficacitatea şi-i vor deschide un larg câmp de acţiune. Colaborarea între selecţia tradiţională şi biologia moleculară vor conduce într-un viitor foarte apropiat la un progres spectaculos al ameliorării cantitative şi calitative a producţiei forestiere.

Note:

* enzimele de restricţie au capacitatea de a tăia macromolecula de ADN în anumite locuri pe care le recunosc cu precizie; ele sunt izolate din diferite bacterii unde îndeplinesc funcţia de a tăia moleculele de ADN străine care pătrund în celula bacteriană; ADN propriu bacterian este protejat contra acţiunii acestor enzime.

** sondă ( sau amorsă) este denumirea dată unei secvenţe scurte de ADN (de regulă de 10-40 nucleotide) care este complementară cu o secvenţă din ADN "ţintă"; prin hibridizare, sonda se cuplează cu secvenţa recunoscută pe baza capacităţii de împerechere a bazelor azotate complementare, respectiv timina se cuplează cu adenina iar guanina cu citozina. Dacă sonda prezintă un capăt 3' liber, ea poate constitui punct de plecare pentru acţiunea unei ADN-polimeraze care va cupla noi nucleotide producând o elongare; în acest caz amorsa se numeşte şi "primer".

*** satelit ADN este denumirea dată unor secvenţe ADN foarte înalt repetate (de 1000 - 100000 de copii) şi foarte lungi, adesea reprezentând regiuni heterocromatice, de 100-300 perechi de baze; se utilizează pentru studiul unor anumiţi loci din genom.

- minisatelit ADN este denumirea unor secvenţe scurte de 10-60 perechi de baze cu diferite grade de repetitivitate ale diferitelor secvenţe; se utilizează frecvent pentru studierea locilor genici.

- microsatelit ADN este denumirea dată unor secvenţe foarte scurte de 1-10 perechi de baze cu o distribuţie dispersată în genom; se utilizează pentru studierea locilor cu o secvenţă foarte scurtă; se numesc şi "secvenţe simple" sau "secvenţe scurte repetate în tandem".

- midisateliţi ADN este denumirea unor secvenţe repetate ale unui locus lung (ca în cazul sateliţilor) dar cu un număr variabil de secvenţe repetate de 40 perechi de baze (ca în cazul minisateliţilor).

Bibliografie

Bahrman N., Petit, J.,R., 1994. Genetic polymorphism in maritime pine (Pinus pinaster Ait.) assessed by two dimensional gel electro-phoresis of needle, bud and pollen proteins. J. Mol. Evol.

Berville A., Tersac M. (edit.), 1995. Techniques et utilisations des  marqueurs moléculaires. I.N.R.A. Paris.

Birot Y., 1994. Biologie moderne et foret. Biofutur, febr. 1994.

Briquet M., 1995. La biologie moléculaire au service de la foręt wallone. Foret Wallone n° 22.

Bronwer S., 1996. Quand la biologie moléculaire s'en mele. Athena, mars 1996.

Caetano-Anollés G., Bassam B., J., Gresshoff P., M., 1991. DNA Amplification Fingerprinting: A Strategy for Genome Analysis. Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 9(4), 294-307.

Caetano-Anollés G., Bassam B., J., Gresshoff P., M., 1991. DNA Amplification Fingerprinting Using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology, Vol. 9, 553-557.

Demesure B., Petit J., R., Comps B., Kremer A., 1992. Universal cytoplasmic primers: methodology and aplication to Fagaceae species. Proceeding of the 5th workshop on molecular biology of forest trees. Carcans-Maubuisson, I.N.R.A. Bordeaux.

Gerber S., 1993. Seed-protein variation in maritime pine (Pinus pinaster Ait.) revealed by two dimensional electrophoresis: genetic determinism and construction of a linkage map. Theor. Appl. Genet. 85, 521-528.

Kremer A., Durel C.,E., Petit R., Villar M., 1994. Marqueurs moléculaires et génétique des arbres forestiers. Biofutur febr. 1994.

Lascoux D.,M., 1993, Growth and phenology of one year old maritime pine (Pinus pinaster Ait.) seedlings under continuous light: implications for early selection. Can. J. For. Res. 23, 1325-1330.

Lefort-Buson M., Rodolphe F., Charcosset A., 1990. De nouvelles perspectives pour l'analyse génétique des caracteres quantitatifs. Biofutur, iunie.

Merel P., 1995. Les challengers de la PCR. Le technoscope de biofutur n°. 143.

Moffat A.,S., 1996. Moving Forest Trees Into the Modern Genetics Era. Science vol. 271, 760-761. Weising.

           Résumé

Modeles génétiques moléculaires des especes forestieres

                Cette travail presente quelques aspects en probleme des modeles génétiques moléculaires aux especes forestieres.

                Il s'agit d'organisation de la variabilitée    génétique,   des   methodes d'interception   en   ce   qui   concerne  la variabilitée génétique aux arbres, modeles moléculaires, la recherche des modeles moléculaires dans croisement et dans les populations naturelles et enfin l'organisation de la diversitée génétique aux arbres et dans un foret.

                Cettes modelles génétiques moléculaires permetera l'étude de la diversitée génétique et la posibilitation de sélection dans un program d'amélioration

Autorul: asist. dr. Ancuţa Mihaela Lucău-Dănilă, Facultatea de Silvicultură Suceava

	Sus
Copyright Staţiunea Experimentală de Cultura Molidului. Toate drepturile rezervate.